1.细胞初步分离

   细胞分离（Cell isolation）是将不同种类细胞彼此分离的技术。可以根据细胞本身的某些特殊性质选择合适的分离技术，这些特性包括：细胞大小、细胞密度、细胞表面电荷、细胞表面标志（例如亲外源凝集素和抗体）、细胞中一个或多个成分的荧光强弱、细胞对其它介质的吸附作用。

   差速离心分离法（Differential centrifugation）根据细胞大小不同，通过逐级增加离心速度来分离细胞，是常采用的分离方法。由于细胞大小不同，沉降速度不同，大的细胞先沉降下来，再用较高
转速将原悬浮于上清中较小的细胞分离沉淀下来，从而达到彼此分离的效果（图3.4）。但是，由于样品中不同大小和密度的细胞是均匀分布在离心介质中的，因此每级分离到的沉淀是不纯的，需要反复悬浮和离心进行纯化。

2.单个细胞的获得
   单个细胞的获得对于细胞纯化、细胞克隆化培养是非常重要的。基于培养的方法有软琼脂培养法和有限稀释法。基于仪器分选的方法有单细胞显微操作法、流式细胞仪分离法、激光捕获显微切割、免疫磁珠分离等。

  有限稀释法 将细胞制成细胞悬液，计数后配制系列浓度梯度的细胞悬液，接种于96孔板等培养器皿中，保证每孔中含有不同数量的细胞，使一些孔中只有一个细胞，这样就可以达到纯化的目的。

  显微镜分离法 借助倒置显微镜用特制的弯头毛细管将单个细胞逐个吸出，移至培养板的小孔中培养。
  流式细胞仪分离 流式细胞仪（Flow cytometer）一般主要由以下几部分组成：
 （1）激光光源，发出合适波长的光。
 （2）流室，细胞样品与鞘液混合包裹，细胞液滴经喷嘴流出，受激光激发发出光信号。
 （3）信号检测器，由光学透镜装置和光电倍增管组成，接收放大光信号，并转换成电脉冲信号。
 （4）信号分析部件，采用计算机处理系统处理分析。
 （5）电场，对流经的单细胞样品施加电场。
 （6）收集系统，对分选的细胞进行收集。
   用超声波处理使细胞团分散成单个细胞，再将细胞悬浮液通过一个直径为 50μm的喷嘴变成极细小的微滴，每个微滴一般含有一个细胞。带电荷不同的细胞经过电场偏向不同方向，下落到下方收集器中。优点是分离速度快、纯度高，可以根据不同的参数或指数来定向地分离细胞。缺点是装置价格昂贵。
   除了分选细胞外，流式细胞仪还可通过荧光染色检测细胞表面标记、细胞增殖周期、区分细胞活性等，也已经成功用于免疫学、肿瘤学、血液学等领域。常以免疫荧光法使荧光抗体与细胞膜表面抗原结合，经激光照射使细胞上所带荧光被激发而转换成脉冲，通过测定脉冲数就可以换算出不同细胞表面抗原的情况。流式细胞仪分选荧光标记细胞示意图如图3.5。

   激光捕获显微切割(Laser capture microdissection, LCM)在组织切片上覆盖一层透明的膜，显微镜下观察组织切片，选择某一特殊细胞后，开启脉冲式红外激光束使膜熔化，冷却后该位置的细胞牢
固地粘附在膜上面，从而实现细胞分离。该方法具有以下优点：
 （1）简单，操作者可以方便地确定所分离的靶细胞。一步即可完成从组织中分离靶细胞，并能保持原有的形态。
 （2）使用无菌、一次性的膜可最大限度地避免可能的污染。
 （3）使膜熔化所需的激光能量很小(<50mW)，能够满足临床病理组织细胞显微分离的需要。
 （4）自动化程度高，可从大量的研究材料中迅速捕获较多的目的细胞。

   免疫磁珠分离（Immunomagnetic beads separation）基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，与磁珠相连的带有表面抗原的细胞被吸附而滞留在磁场中，不能与磁珠连接着的细胞不在磁场中停留，从而使目的细胞得以分离。免疫磁珠法分为阳性分离法和阴性分离法：

   阳性分离法 磁珠结合的细胞是所要分离获得的细胞。

   阴性分离法 磁珠结合不需要的细胞，离开磁场的细胞为所需细胞。