赤潮微藻的分离方法

1 采样

    就是采集生长有所需要分离赤潮微藻的水样或沉积物。

1.1水样采集

    水样采集最好在赤潮爆发期间进行，此时赤潮微藻是优势种，很容易获得单种。在长期进行监测的水体，有时虽然没有发生肉眼可见的赤潮，但是水体中赤潮微藻的密度也比较大，这时进行藻种分离成功的机率很大，应立即进行分离。在海水养殖池塘或近岸海域，若有赤潮藻出现，但是密度很低时分离比较困难，最好进行预备培养，当目标藻达到一定密度以后再行分离。

1.2沉积物样品采集

    沉积物中存在某些赤潮藻尤其是甲藻的孢囊，在环境条件适宜时它们可重新萌发形成营养细胞而密集于海面。因此，在采集水样的同时采集沉积物也是获得赤潮微藻的一种重要途径。

2 预备培养

2.1水样预备培养

    水样预备培养就是根据水样中目标藻的种类和数量，选择合适的培养液并提供适宜的生长条件进行培养，使目标藻在水样中达到易于分离的密度或成为优势种。一般进行预备培养的水样，其目标藻的种类并非单一。因此，为了获得多种目标藻，需要将水样分装，然后分别加入适合各种目标藻生长的培养液；或者对于急需而又无法通过其他途径获得的某种目标藻，可以采用使用不同培养液的方式进行培养以确保有效分离获得。

    预备培养的营养盐浓度要低些，一般只用原配方浓度的1/4～1/2，甚至有人使用1/10浓度。对于一些难以培养的种类，可采用适当加入海泥抽取液、补充微量元素或维生素等以及加入选择性药品如抗生素等方法以获得较好的培养效果。若仍然繁殖不起来，可通过更换培养基、培养条件、培养方式等加以解决。此外，在预备培养过程中，随着微藻的生长繁殖还要相应地补充一些营养盐。

预备培养过程中要经常注意观察培养液颜色变化情况，稍有颜色出现即进行镜检，如有目标藻出现且占优势，立即进行分离；如目标藻不占优势，可继续培养使其密度增大以待分离，或加入选择性抑制剂抑制杂藻使目标藻逐渐发展起来，若上述两种方法都不妥则立即进行单胞分离以免目标藻被竞争掉而使分离工作夭折；如没有目标藻出现，可再培养一段时间，或更换另一种培养液，则有可能达到分离要求。

2.2沉积物样品预备培养

    沉积物样品预备培养最简单的方法是将样品用网筛过滤，将获得的含孢囊的滤液放入小试管或小烧杯内，加入培养液培养。镜检孢囊的萌发状况并鉴定营养细胞的种类。然后根据2.1中水样的预备培养方法进行操作即可。

3 分离

3.1 水样中赤潮微藻分离

    水样中赤潮微藻的分离方法，通常采用下列几种：

3.1.1微吸管分离法 将稀释适度的待分离水样置于灭菌的载玻片上，用拉制的微吸管或购买的毛细管在显微镜下仔细地吸取单个目标藻细胞，然后将吸取的水滴放在另一灭菌载玻片上，镜检。若这滴水中混有其他生物，反复分离直至达到单胞分离；或将该水滴再次培养，然后用同样的方法进行分离，重复几次直至达到单胞分离。然后将分离得到的单个细胞移入经灭菌的培养液中进行培养。

    该法操作技术要求较高，仅适宜分离个体较大的赤潮藻类。赤潮微藻很多种类具有鞭毛，因此操作难度更大，这就要求工作人员反复实践以熟练掌握技巧。

3.1.2水滴分离法 用微吸管吸取稀释适度的待分离水样，小心地以直线形式间隔滴到灭菌的载玻片上，每片载玻片上滴2～4滴，水滴大小以在低倍镜下能看到水滴全部或大部分为宜，然后在显微镜下逐滴镜检。选取无其它生物混杂的水滴，用灭菌吸管吸取灭菌培养液将其冲入装有灭菌培养液的试管或小三角瓶中培养。若小水滴内含有多种生物，则需反复稀释、分离，直至小水滴中只含有一个或几个同种目标藻细胞。

    该法简便易行，对于赤潮微藻细胞的大小没有限制，对分离具鞭毛的赤潮微藻种类更为适宜，尤其适于分离已在培养液中占优势的微藻种类。

3.1.3稀释分离法 将水样稀释至每滴含有一个左右目标藻细胞，然后在15～20支盛有5 mL左右灭菌培养液的试管中各滴入一滴，摇匀后常规培养。待每管藻细胞达到一定密度后再镜检，若藻群落不纯，需要重复上述操作若干次。

    该法简便易行，对于赤潮微藻细胞的大小没有限制，对分离具鞭毛的赤潮微藻种类更为适宜。由于一次可进行多个试管操作，成功率较高。

3.4 抗生素分离法 在水样中加入适量选择性较强的抗生素，则抑制或杀死混杂生物而使目标藻得以生长繁殖并逐渐成为优势种。

    该法简便易行，对于赤潮微藻细胞的大小没有限制，对分离具鞭毛的赤潮微藻种类更为适宜。但是抗生素种类和剂量等的选择需慎重，有时则需要多种抗生素同时使用。该法也可以作为预处理，同其他分离方法联合使用。

3.2 沉积物中赤潮微藻分离

    按2.2中的预备培养方法获得营养细胞后可根据3.1的方法进行分离。

    此外，还可以将2.2中网筛过滤获得的孢囊直接进行单孢囊分离，将获得的单个孢囊培养在灭菌培养液内即可获得单胞赤潮微藻。

参考文献：