1. 细胞保存方法

  传代培养保存法: 悬浮培养的细胞通过每隔1~2周换液进行一次传代培养。高等植物、微藻等的细胞培养一般都采用这种方法。一般选择较低的培养温度。

  低温冷冻保存法：是在低温下冻存细胞进行保存的方法。包括：

 （1）低温保存：-20℃左右温度保存细胞；

 （2）超低温保存：是指液氮（-196℃）保存。细胞代谢和生长几乎完全停止。超低温保存时细胞和组织不会丧失形态发生潜能，也不会发生遗传性状改变，理论上可以无限期贮藏。超低温冷冻保存法是目前主要的细胞保存方法，已广泛应用于医学和畜牧业，例如液氮中贮藏精子进行人工授精已成为一种常规方法。

  液体的固化有两种方式：一种是形成冰晶，另一种是形成无定形的玻璃化(vitrification)状态。根据冻存液在冻结后是否形成冰晶，低温冷冻保存细胞可分为非玻璃化冻存和玻璃化冻存两种。

细胞内含有大量的水分，低温冻存细胞时，当温度降到冰点以下时细胞内外的水分就会形成冰晶。冰晶的形成使细胞脱水，导致细胞内局部电解质浓度增高，pH改变，使蛋白质和酶活性改变，从而引起细胞内结构的破坏，最终使细胞死亡。

  玻璃化 (vitrification)是指液体转变为非晶态(玻璃态)的固化过程，与平常所见到的冻结(Freezing)过程不同。在玻璃态时，水分子没有发生重排，不产生结构和体积的变化，因而不会由于机械或溶液效应造成组织和细胞伤害，化冻后的细胞仍有活力。

  细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分,减少细胞内冰晶的形成。为了降低冷冻对细胞产生的损伤，需要重点考虑保护剂使用和冷冻方法两个重要因素。

2.冷冻保护剂

  冷冻保护剂（Cryoprotectant）是指可以保护细胞免受冷冻损伤的对细胞无明显毒性的物质，可分为渗透性和非渗透性两类。

  渗透性保护剂 主要包括甘油、二甲亚砜（ dimethylsulfoxide，DMSO）、乙二醇、乙酰胺和甲醇等。其中，甘油和DMSO是细胞冻存中最常用的两类冷冻保护剂。渗透性保护剂的分子质量一般较小，易与水分子结合，易穿透细胞膜进入细胞内部，从而可以降低细胞的冰点、提高细胞膜对水的通透性。冻存时，保护剂可促进细胞内水分渗出细胞外，从而减少胞内冰晶的形成。复苏时，促进胞外水分进入细胞，缓解渗透性肿胀引起的损伤。

  非渗透性冷冻保护剂 一般是些大分子物质，不能渗透到细胞内部，主要包括聚乙烯吡咯烷酮 (Polyvinyl pyrrolidone，PVP)、蔗糖 (Sucrose)、聚乙二醇(Polyethylene glycol，PEG)、葡聚糖(Dextran)、白蛋白(Albumin)及羟乙基淀粉 (Hydroxyethyl starch，HES)等。这类物质不能进入细胞内部，但能溶于水，可稀释细胞外电解质的浓度，从而减少溶质损伤。另外，这些大分子物质可结合水分子，降低细胞外自由水的含量，减少胞外冰晶的形成。

3.冷冻方法

  冷冻过程中，若冷却速度过慢胞外溶液中水分大量结冰，溶液浓度提高，胞内水分大量渗出，导致细胞强烈收缩并造成化学损伤。如果冷却速度过快，胞内水分来不及通过细胞膜向外渗出，胞内溶液结冰从而造成物理损伤。因此，细胞的冻融要选择合适的降温速度。

  超低温保存的具体方法包括缓慢冷冻、快速冷冻、预冷冻等。

  缓慢冷冻法 将处于0℃或其他预处理温度的材料以1~2℃/min的降温速度从起始温度降到-100℃，稳定1h后投入液氮中保存或以此降温速度连续降温至-196℃的方法。按 1mL/安瓿的量分装细胞悬液，在火焰下将安瓿封口。将封口的安瓿放入慢冻机内，添加保护剂的细胞悬液按照一定梯度降低温度进行缓慢冷冻。当温度在-25 ℃以上时，可以按照 1~2 ℃/min的梯度降温；当温度达-25 ℃以下时，可以按照 5~10 ℃/min的梯度降温。当温度达-100℃时，可迅速放入液氮罐中（温度可达-196℃），此时细胞的全部生理生化活动几乎处在停止状态。细胞内水分有充分的时间不断渗到细胞外结冰，使细胞内水分减少到最低限度，实现保护性脱水来避免细胞内结冰。此法适用于成熟的、含有大液泡和含水量高的细胞，对于悬浮细胞的保存特别有效。慢速冷冻法降温时需程序降温仪或计算机来控制降温器。可采用具有梯度降温功能的冷冻仪实现程序性逐级冷冻。缓慢冷冻过程中，细胞外水分先结冰，胞外电解质浓度升高，使细胞内的水分渗出，在细胞外形成冰晶，减少胞内冰晶的形成，从而减少胞内冰晶对细胞的损伤。一般来说，缓慢冷冻比快速冷冻对细胞结构影响小，复苏率高。当然，降温速度也不能太慢，否则细胞会因失水过多而死亡。

  预冷冻法 又包括两步冷冻、逐级冷冻两种，前者是将预处理后的材料先通过慢速冷冻法降温至-40℃，保存一段时间 (约30min左右)后，再投入液氮中保存。后者将经过预处理的材料先制备成不同温度等级的溶液，如-10℃、-15℃、-23℃、-35℃及-40℃，并在每级温度中停留一定时间(4~6min)，然后将材料投入液氮中保存。

  快速冷冻法 将材料从0℃或者其他预处理温度直接投入液氮中保存的方法。这一方法的关键就是利用高速降温越过冰晶增长的危险温度区，使细胞内来不及形成大小可以致死细胞的冰晶。快速降温越过危险温度区后，细胞内水分会固化，形成“玻璃化” (Vitrification)状态。实验表明，融冻速度愈快，细胞存活率越高。理论上，只要获得足够快的降温速度，任何液体都可以进入玻璃化状态。要使纯水玻璃化，降温速度需高达101℃/s，实际上难以达到。通过添加高浓度的冷冻保存剂，可以显著降低形成玻璃化所要求的降温速度。玻璃化固体可以避免冷冻时在细胞内形成冰晶对细胞产生的伤害。大部分低温保护剂都可以用于制备玻璃化冷冻保护液。现有的降温速度条件下，要使溶液玻璃化，保护剂的浓度大约需要达到40％~60％(W/V)的高浓度。但是，高浓度的保护剂会对细胞产生溶质损伤。因而根据不同冷冻保护剂的玻璃化形成能力、毒性以及对细胞的渗透能力，把各种保护剂混合使用，可降低每种保护剂的使用浓度并减少对细胞的毒性。一种常用的动物细胞冻存液是在 Hanks平衡盐溶液中加入20.5％DMSO(W/V)、15.5％乙酰胺(W/V)、10％丙二醇和10％聚乙二醇(分子质量为8000u)，并用 NaOH调pH至7.4。使用之前置冰浴中预冷。对于不同的动物细胞，冻存液中各冷冻保存剂的最适浓度会有很大不同。

4.细胞复苏

  细胞的复苏是按一定复温速度将细胞悬液由冻存状态恢复到常温的过程。在-70℃以下时细胞内的生化反应极其缓慢，甚至停止。当恢复到常温状态下，细胞的生化反应即可恢复。

  在细胞复苏过程中，如果复温速度不当也可能引起细胞内结冰 (重结冰)而造成细胞损失。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，细胞复苏一般采用快速融化法，以保证细胞外冰晶快速融化，避免慢速融化时水分渗入细胞内再次形成胞内结晶造成细胞损伤。在复苏时，从液氮中取出冻存管，一般以很快的速度升温，1~2分钟内恢复到常温，使细胞迅速通过最易受损的-5~10℃，细胞内外不会重新形成较大的冰晶，也不会暴露在高浓度溶质的溶液中过长时间，最大限度地减少冰晶和溶质对细胞的损伤，使复苏后的细胞保持其正常的结构和功能。

 来源：细胞工程课程 http://celleng.sjtu.edu.cn